CellResearch哺乳动物ALK [复制链接]

6mA是原核生物基因组DNA最常见的修饰。在限制修饰系统（restriction-modification）中，6mA主要被原核生物用来保护自己的基因组免于外源DNA入侵。但是6mA是否存在于哺乳动物中一直存在着较大争议。ALKBH1是哺乳动物中Fe(II)-α-酮戊二酸双加氧酶超家族中AlkB家族的成员，与5mC去甲基化酶Tet结构相近，但是其真实底物也存在着较多争议。年发表在cellresearch上的“MammalianALKBH1servesasanN6-mAdemethylaseofunpairingDNA”研究，很好的解答了部分争议。

首先，研究者通过建立了基于液相-质谱（LC-MS/MS）的定量酶活检测体系，系统地检测了ALKBH1对各类核酸底物的去甲基化酶活，发现ALKBH1偏好催化局部开链的鼓泡DNA，而非之前认为的ssDNA中6mA去甲基化，且完全无法催化dsDNA中的6mA去甲基化。同样使用这个LC-MS/MS酶活检测体系，发现ALKBH1可以同样高效催化多种局部非配对的核酸（如bulge、R-loop、D-loop和stemloop等）中6mA的去甲基化，而对碱基序列没有特别偏好，首次阐明了ALKBH1对底物二级结构的高度依赖性（图1）。

图1.ALKBH1偏好局部未配对的DNA作为底物，而不是ssDNA或dsDNA

同时，研究者建立的以核苷消化的形式分析去甲基化产物的质谱测活方法，成功捕获了6mA去甲基化过程的中间产物N6-羟甲基腺嘌呤（6hmA），为ALKBH1催化的化学机理提供了新证据。6hmA在非酶促条件下，可以稳定存在数小时，提示6hmA有可能作为一种亚稳态表观修饰参与调控（图2）。

图2.在ALKBH1对N6-mA去甲基化的过程中检测到了N6-hmA

紧接着，研究者通过解析了2.5?分辨率的小鼠ALKBH1的自由态结构，发现其由位于N端的延长区域（NTE）、相邻的底物识别亚结构域（NRL）以及C端的催化结构域（DSBH）构成，其中NRL亚结构域又可细分为Flip1和Flip2两部分。Flip1远离酶活中心且外翻伸展，不同于其它AlkB家族成员以及Tet2“回扣式”的Flip1构象（图3）。已有研究表明，“回扣式”Flip1构象对于稳定双链DNA修饰碱基外翻，促使其伸向活性中心完成催化有着重要作用。ALKBH1中Flip1的伸展构象导致其失去了自主外翻DNA碱基的能力，因此ALKBH1无法催化双链DNA底物，而其酶活发挥需要碱基的预先翻转。

图3.小鼠的ALKBH1结合Mn(II)和NOG的结构

随后，研究者通过二硫键交联的方法（图4a），使原本结合较弱的ALKBH1和21-mer的鼓泡DNA底物形成稳定、均一的复合物，并最终解析了分辨率2.4?的复合物晶体结构（图4）。复合物结构表明，ALKBH1伸展的Flip1与其N端的α1位于催化中心两侧，分别与翻转碱基左右两侧的双链区域互作。其中，α1和Flip1上的R24和R残基分别以“精氨酸手指”的方式插入到DNA双链区域的小沟中，协助将DNA鼓泡外翻的修饰碱基呈递至催化中心实现去甲基化。复合物结构解析突显了局部非配对底物双链区在ALKBH1底物识别过程中的关键作用，阐明了ALKBH1偏好催化局部开链核酸底物而非单链底物的原因。

图4.ALKBH1与21-mer的鼓泡DNA的复合物晶体结构

最后，研究者进一步对小鼠早期胚胎发育细胞进行DIP-seq以及ssDNA-seq分析，发现N6-mA与基因组的非配对区域存在着显著的共定位，暗示着N6-mA的调控可能与真核生物染色体高级结构的动态变化密切相关（图5），这将为后续哺乳动物中ALKBH1以及6mA的功能研究提供全新的视角。。

图5.小鼠基因组中N6-mA与ss-DNA区域的共定位

该研究通过建立稳定可靠的体外酶活检测体系，首次鉴定出ALKBH1为一类局部非配对DNA的N6-甲基腺嘌呤（6mA）去甲基化酶；首次解析了ALKBH1自由态以及与DNA底物结合的复合物结构，揭示了ALKBH1偏好局部非配对核酸底物的结构基础，为哺乳动物中6mA的调控生物学提供了全新的研究视角。也为现在充满争议的6mA研究提供了强有力的实验证据，毕竟蛋白结构是功能的基础，结构解析往往为我们了解蛋白提供了“眼见为实”的证据。